結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（GBSS）活性檢測試劑盒說明書
規(guī)格：25T/24S、50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系工作人員。
試劑名稱/規(guī)格 | 25T | 50T | 保存條件 |
提取液 | 液體 50 mL×1 瓶 | 液體 100 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
試劑一 | 液體 20 mL×1 瓶 | 液體 40 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1 瓶 | 粉劑×2 瓶 | 4℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1 瓶 | 粉劑×2 瓶 | -20℃保存 |
試劑四 | 粉劑×1 瓶 | 粉劑×2 瓶 | -20℃保存 |
試劑五 | 粉劑×1 瓶 | 粉劑×2 瓶 | -20℃保存 |
試劑六 | 粉劑×2 支 | 粉劑×4 支 | -20℃保存 |
試劑七 | 液體 250 μL×2 支 | 液體 250 μL×3 支 | -20℃保存 |
試劑八 | 液體 12.5 μL×1 瓶 | 液體 12.5 μL×2 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑四：臨用前每支加入 5 mL 試劑一。
2、 試劑五：臨用前每支加入 8 mL 試劑一。
3、 試劑六：臨用前取 1 支加入 208 μL 雙蒸水，充分溶解備用，用不完的試劑 4℃保存。
4、 試劑八：每支臨用前加入溶解好的 4 mL 試劑四。
5、 反應(yīng)液Ⅰ的配制：臨用前在試劑二中加入 7 mL 試劑一，緩慢加熱，逐漸升溫使其溶解，冷卻后加入試劑三混合溶解，這樣可
以分兩批配制并且測定。
GBSS（EC 2.4.1.21）以束縛態(tài)存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長反應(yīng)，主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。
GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng),將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時(shí)生成ADP；進(jìn)一步通過反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為NADPH，其中NADPH生成量與前一步反應(yīng)生成的ADP數(shù)量呈正比，通過340nm下測定NADPH的增加量，可以計(jì)算GBSS活性。
增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
稱取約 0.1g 組織加入 1mL 提取液，冰浴中勻漿。10000g ，4℃離心 10min，棄上清，在沉淀中加入 1mL 提取液充分混勻，置冰上待測。
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 在EP管中按順序加入下列試劑
試劑名稱（μL） | 測定管 |
樣本 | 200 |
反應(yīng)液Ⅰ | 270 |
混勻，30℃保溫20min，置沸水浴中1min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻 | |
試劑八 | 150 |
混勻，30℃保溫30min，置沸水浴中1min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，10000g 常溫離心10min，取上清液。37℃預(yù)熱試劑五和上清液。 | |
上清液 | 450 |
試劑五 | 300 |
試劑六 | 15 |
試劑七 | 15 |
混勻后立即在 340nm 波長下記錄初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。GBSS活性（U/mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V測]÷(Cpr×V樣÷V反總×V上清) ÷T =43.2×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。GBSS活性（U/g 質(zhì)量）=[ΔA÷（ε×d）×V測]÷(W÷V提取×V樣÷V反總×V上清) ÷T=43.2×ΔA÷W
V測：測量體積，0.78mL；V反總：反應(yīng)體積，0.62mL；V提取：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；ε： NADPH消光系數(shù)，6.22×10-3mL/(nmol˙cm)；d：石英比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本的量，0.2mL；V上清：吸取上清液的量，0.45mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。
