一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中，特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號(hào)傳遞的作用，是一種新型的生物信使分子，在機(jī)體的生理、病理過(guò)程中起著重要的作用。
測(cè)定原理：
NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成 NO2-，在酸性條件下，NO2-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測(cè)定其吸光值，可以計(jì)算NO含量。為了排除樣品色素等的影響，每個(gè)樣品需做對(duì)照管。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、研缽或勻漿器、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 3mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體 3mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：液體 6mL×1 瓶，4℃避光保存。
樣品處理：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g，4℃離心 15min，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心 15min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測(cè)定。
測(cè)定步驟和操作表：
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm。
2、 操作表
對(duì)照管 | 測(cè)定管 | |
樣品（μL） | 100 | 100 |
試劑一（μL） | 50 | |
試劑二（μL） | 50 | |
試劑三（μL） | 50 | 50 |
混勻，室溫靜置 15min，于微量石英比色皿/96 孔板，對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定 550nm 處吸光 值，記為 A 550 。 | ||
NO 含量計(jì)算：
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為：y=0.016x-0.0103，R2=0. 9986
1、組織樣品：
NO含量定義：25℃時(shí)，每克樣品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO2-，相當(dāng)于1μmoL NO。
（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算
NO 含量（μmoL/g）=（A 550 +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）×10 -3
= 0.125×（A 550 +0.0103）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算
NO 含量（μmoL/mg prot）=（A 550 +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣×Cpr）×10 -3
= 0.125×（A 550 +0.0103）÷Cpr
2、其他樣品：
NO 含量定義：25℃時(shí)，每升樣品15min生成 1μmoL NO2-，相當(dāng)于1μmoL NO。
NO 含量（μmoL/L）=（A 550+0.0103）÷0.016×V 反總÷V 樣
= 125×（A 550+0.0103）
V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為：y= 0.008x-0.0103，R2=0. 9986
1、組織樣品：
NO含量定義：25℃時(shí)，每克樣品或每毫克蛋白15min生成 1μmoL NO2-，相當(dāng)于1μmoL NO。
（1）按樣本重量計(jì)算
NO 含量（μmoL/g）=（A 550 +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）×10 -3
= 0.25×（A 550+0.0103）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算
NO 含量（μmoL/mg prot）=（A 550+0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣×Cpr）×10 -3
= 0.25×（A 550+0.0103）÷ Cpr
2、細(xì)胞
NO 含量定義：25℃時(shí)，每104個(gè)細(xì)胞15min 生成 1μmoL NO2-，相當(dāng)于1μmoL NO。
NO 含量（μmol/104cell）=（A 550+0.0103）÷0.008×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）×10 -3= 0.25×（A 550+0.0103）÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）
3、 其他樣品：
NO 含量定義：25℃時(shí)，每升樣品 15min 生成 1μmoL NO2-，相當(dāng)于1μmoL NO。
NO 含量（μmoL/L）=（A 550 +0.0103）÷0.008× V 反總÷V 樣= 250×（A 550 +0.0103）
V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，
1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
