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豬胰島素(INS)ELISA試劑盒

使用手冊

產(chǎn)品編號：HB055-Pg

使用前請仔細閱讀本手冊。如果有任何問題，請聯(lián)系我們,我們會給你提供專業(yè)的技術(shù)服務。

【產(chǎn)品名稱】

中文名稱：豬胰島素(INS)酶聯(lián)免疫試劑盒

【包裝規(guī)格】

96T/盒

【預期用途】

僅供科研使用，定量檢測血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清液等相關(guān)樣本中豬胰島素(INS)的濃度。

【檢測原理】

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中豬胰島素(INS)水平。用純化的豬胰島素(INS)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入豬胰島素(INS)，再與HRP標記的豬胰島素(INS)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的豬胰島素(INS)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中豬胰島素(INS)濃度。

【產(chǎn)品性能】

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無破損漏氣(如有漏氣，不影響使用）。

2、劑量反應曲線線性

標準品劑量反應曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900。

3、檢測范圍

3 mIU/L- 80 mIU/L 。

4、靈敏度

最低檢出劑量小于0.75 mIU/L。

5、精密度

精密度用樣品測定值的變異系數(shù)CV 表示。CV（%） = SD/mean×100

批內(nèi)差：取同批次試劑盒對低、中、高值定值樣本進行定量檢測，每份樣本連續(xù)測定20 次，分別計算不同濃度樣本的平均值及SD 值。

批間差：選取3 個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本進行定量測定，每個樣本使用同一試劑盒重復測定10 次，分別計算不同濃度樣本的平均值及SD 值。

批內(nèi)差： CV<5.2%

批間差： CV<8.6%

6、回收率

分別往5個不同樣本中添加已知濃度的目標蛋白，做回收實驗，得出回收率范圍和平均回收率。

7、線性

分別往5個樣本中添加已知濃度的目標蛋白，做回收實驗，得出回收率范圍及平均回收率。將5個樣本分別稀釋2倍，4倍，8倍，16倍做回收實驗，得出回收率范圍及平均回收率。

8、特異性

本試劑盒識別天然和重組豬胰島素(INS)，經(jīng)檢測與其它相似物質(zhì)無明顯交叉反應。由于受到技術(shù)及樣本來源的限制，不可能完成所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應檢測，因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測的其它物質(zhì)有交叉反應。

9、穩(wěn)定性

經(jīng)測定，試劑盒在有效期內(nèi)務必按推薦溫度保存，活性降低率小于5%。為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實驗室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。

【試劑盒組成】

注意：使用前請檢查試劑盒中試劑的標簽和數(shù)量與表格是否一致。

需要但未提供的材料及耗材

  1、酶標儀（建議儀器使用前提前預熱）

2、精密移液器、吸頭、加樣槽

3、蒸餾水或去離子水

4、洗瓶或者自動洗板機

5、37℃水浴鍋或恒溫箱

6、EP管

7、無粉一次性乳膠手套

【儲存條件及有效期】

  1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個月。

  2、開封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。

注意：試劑盒內(nèi)酶標條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在首次實驗后1 個月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過期時間以盒子上的標簽為準，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。

【適用儀器】

  半自動的酶標儀，如Thermo MK3，或者國產(chǎn)酶標儀。

【樣本要求】

1.樣本類型和采集

血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置0.5-2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
    血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

細胞裂解液: 吸棄培養(yǎng)液，用PBS（0.01 M，pH 7.4）將細胞洗一遍。用細胞刮刮下細胞（不能用胰酶和EDTA 處理），加入2-5 mL PBS（0.01 M，pH 7.4）。懸浮細胞可省略。收集細胞懸液，4℃ 1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS潤洗3次。加入適量的預冷PBS或非變性細胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細胞,通常6孔板一個孔的細胞量需要150-250μL PBS重懸。 將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復凍融3次，使細胞充分裂解,也可將樣品進行超聲破碎，以達到裂解的目的。4℃ 10000×g 離心10min，除去細胞碎片，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2.樣本保存和穩(wěn)定性

樣本在2-8℃條件下，可以儲存72h，在- 20℃或-80℃可以儲存6個月及以上。樣本收集后，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存，避免反復凍融。

【操作步驟】

1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

8. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10-20分鐘。

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

注意：

1. 試劑準備：試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用。準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

2. 加樣：實驗操作中請使用一次性的滅菌吸頭，避免污染。加樣時注意不要有氣泡產(chǎn)生，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。與反應試劑加入一樣，加樣過程中第一個孔與最后一個孔加樣時間間隔盡量?。ㄒ话憧刂圃?/span>10 分鐘以內(nèi)），如果太大，將會導致不同的“預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。為了測值的準確性，推薦設置復孔進行實驗。

3. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài)，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4. 洗滌：濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。充分洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應孔內(nèi)殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將吸水紙直接放入反應孔中吸水，同時要輕輕擦除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標儀讀數(shù)。如果使用自動洗板機，請在熟練使用后再用于正式實驗過程中。

5. 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化，如觀察到顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強而影響酶標儀光密度讀數(shù)。

6. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

【操作程序總結(jié)】

【注意事項】

1. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

2. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

3. 為免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和試管。

4. 要嚴格避免操作過程中酶標板干燥。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活。  

5. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。

6. 顯色時間供參考，因用戶實驗室條件差異，最佳顯色時間會有所不同。

7. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

8. 本試劑不同批號組分不得混用。

9. 揭封板膜和覆蓋封板膜時應避免用力過大導致液體濺出。

【結(jié)果計算】

  以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

【常見問題及解決方法】

若實驗效果不好，請及時對顯色結(jié)果拍照，保存實驗數(shù)據(jù)，保留所用板條及未使用試劑，然后 聯(lián)系我公司技術(shù)支持為您解決問題。同時您也可以參考以下資料：

【文獻精選】

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5. Smartphone-based rapid quantitative detection of luteinizing hormone using gold immunochromatographic strip

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